PCR cuantitativa - Quantitative PCR (sinónimos: PCR cuantitativa en tiempo real)

Uso de PCR para determinar la cantidad de ADN o ARN en una muestra; se utiliza frecuentemente para detectar mutaciones por deleción y mutaciones por duplicación.

Anteriormente, la PCR cuantitativa determinaba la cantidad de producto (ADN o ARN) tras completar un número específico de ciclos; sin embargo, este procedimiento no es del todo fiable o preciso y se ha sustituido en gran parte por la PCR cuantitativa “en tiempo real” (denominada también “cinética”), en la que se determina la cantidad del producto (ADN o ARN) tras completar cada ciclo de PCR.

PCR cuantitativa en tiempo real

I. Se amplifica la región de ADN o ARN de interés en presencia de una sonda fluorescente; la intensidad de la señal fluorescente generada aumenta en proporción a la cantidad de producto resultante en PCR.

II. La intensidad de la señal fluorescente, que se mide al completar cada ciclo de PCR, se representa en una “gráfica de amplificación” para determinar el CT (del inglés cycle threshold), que se define como el punto en el que se detecta por primera vez la señal fluorescente, es decir, el producto de la PCR.



III. Se compara el valor CT frente a una curva estándar (basándose en los valores CT de muestras control y sus respectivas cantidades iniciales de ADN o ARN conocidas) para determinar la cantidad de ADN o ARN en la muestra del paciente. La presencia de una mutación por deleción o duplicación se puede deducir comparando la cantidad de ADN o ARN en la muestra del paciente con la cantidad en una muestra control. Por ejemplo, si la cantidad de ADN o ARN en la muestra del paciente fuese ~50% respecto a la del control normal, esto indicaría una mutación por deleción; si la cantidad de ADN o ARN en la muestra fuese ~150% respecto a la del control normal, indicaría una mutación por duplicación.

1Adaptado de PennState College of Medicine, Quantitative Real-Time PCR
 

 

Algunas implicaciones clínicas

Al igual que la PCR, la PCR cuantitativa se ha convertido en una técnica estándar en todos los laboratorios clínicos de genética molecular.

Los análisis para detectar mutaciones por deleción hemicigótica (p. ej. deleciones en DMD en varones afectados por distrofia muscular de Duchenne) se pueden realizar con técnicas de PCR estándar. Sin embargo, se debe realizar PCR cuantitativa, en lugar de estándar, para detectar mutaciones por deleción heterocigótica (p. ej. deleciones heterocigóticas en (1) individuos afectados por un trastorno causado por una deleción en un gen contiguo autosómico, como, por ejemplo, el síndrome de Williams, (2) portadores de un trastorno autosómico recesivo, como la atrofia muscular espinal y (3) mujeres portadoras de un trastorno ligado al cromosoma X, por ejemplo la distrofia muscular de Duchenne).